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試劑盒名稱(chēng)：

雞熱休克蛋白70（HSP-70）定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）

試劑盒用途：

定量檢測(cè)雞血清、血漿及相關(guān)液體樣本中熱休克蛋白70（HSP-70）的含量。

檢測(cè)原理：

本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本加入到預(yù)先包被雞熱休克蛋白70（HSP-70）單克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分，再加入酶標(biāo)工作液，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根過(guò)氧化物酶（HRP）催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，在酸的作用下變成，顏色的深淺與樣品中雞熱休克蛋白70（HSP-70）濃度呈正相關(guān)，450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值，計(jì)算樣本中雞熱休克蛋白70（HSP-70）含量。

【試劑盒組成】

1
 酶標(biāo)包被板
 12孔×8條
 7
 顯色劑A液
 6mL
 
2
 標(biāo)準(zhǔn)品
 0.3mL×6管
 8
 顯色劑B液
 6mL
 
3
 20倍濃縮洗滌液
 25mL
 9
 終止液
 6mL
 
4
 樣本稀釋液
 6mL
 10
 說(shuō)明書(shū)
 1份
 
5
 特殊稀釋液
 6mL
 11
 封板膜
 2張
 
6
 酶標(biāo)試劑
 6mL
 12
 密封袋
 1個(gè)
 

備注：標(biāo)準(zhǔn)品（1號(hào)→6號(hào)）濃度依次為：160、80、40、20、10、5 ng/L.

【需要而未提供的試劑和器材】

1、37℃恒溫箱

2、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

3、精密移液器及一次性吸頭

4、蒸餾水

5、一次性試管

6、吸水紙

【操作步驟】

1、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。

2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測(cè)樣本孔中先加入待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對(duì)照孔不加。

4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說(shuō)明書(shū)操作洗板）。

6、加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μL，空白對(duì)照孔不加。

7、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

8、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機(jī)按說(shuō)明書(shū)操作洗板）。

9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，平板混勻器混勻30s（或用手輕輕震蕩混勻30s），37℃避光顯色15min。

10、終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。

11、測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。

12、計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。zui終濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)。

【樣本要求】

1、樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因?yàn)榀B氮鈉（NaN3）是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的抑制劑。

2、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能立即試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3、樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒。

【注意事項(xiàng)】

1、實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

2、酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。

3、建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照都做雙份檢測(cè)，取平均值，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。

4、牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍，計(jì)算結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。

5、本試劑盒定量范圍為5-160ng/L，超過(guò)此范圍，為標(biāo)準(zhǔn)曲線延伸計(jì)算所得，不做為準(zhǔn)確定量結(jié)果，請(qǐng)用特殊稀釋液稀釋后測(cè)定準(zhǔn)確結(jié)果（5-160ng/L范圍內(nèi)），乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本zui終濃度。

6、若顯色過(guò)淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)底物溫育時(shí)間。

7、為避免交叉污染，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照每加一個(gè)就要更換一次吸頭；酶標(biāo)工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。

8、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號(hào)的試劑不得混用。

9、底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。

【操作程序總結(jié)】

準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板4次，加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板4次，加入顯色液A、B，37℃顯色15分鐘

加入終止液

15分鐘之內(nèi)讀OD值

計(jì)算

【檢測(cè)范圍】

5ng/L - 160ng/L

【規(guī)格】

96人份/盒

【貯藏】

2-8℃，避光防潮保存。