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ELISA試劑盒測定現在一般為選用手工操作的以微孔板條為固相的測定形式，測定操作非常簡略，一般涉及到標本的搜集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、作用判別和作用陳述及說明等方面，其間任一進程的不當都會影響測定作用，且尤以加樣、溫育和洗板等進程為甚。現分述如下。
一、臨床標本的搜集和保存
用于ELISA測定的臨床標本zui為常用的是血清（漿），有時由于特定的查看目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、大便等標本。現在臨床上運用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標本的搜集，要留心搜集時間甚或體位有或許會對測定作用發作影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現：成長激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發性方法開釋，因此，在測定此類激素時，有必要在接近相連的時間間隔內采用數份血樣本，以其間間值為測定值。又如當從臥位變為站立位時，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療藥物的查看，應根據藥代動力學選擇服藥后的zui適時間抽血查看。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的查看的血清標本的搜集則沒有時間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要思考以下幾個方面：
（1）要留心避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為符號酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很簡單在溫育進程中吸附于固相，然后與后邊參與的HRP底物反應顯色。
（2）樣本的搜集及血清分別中要留心盡量避免細菌污染，一則細菌的成長，其所排泄的一些酶或許會對抗原抗體等蛋白發作分解作用；二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶自身會對用相應酶作符號的測定方法發作非特異性煩擾。
（3）血清標本如是以無菌操作分別，則可以在2～8℃下保存一星期，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。
（4）冰凍保存的血清標本須留心避免因停電等形成的重復凍融。標本的重復凍融所發作的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子發作損壞作用，然后致使假陰性作用。此外，凍融標本的混勻亦應留心，不要進行劇烈振動，重復倒置混勻即可。
（5）標本在保存中如出現細菌污染所形成的的混濁或絮狀物時，應離心沉積后取上清查看。
二、ELISA試劑盒試劑準備
在臨床實驗室，對試劑準備一般不太留心，一般的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有或許影響后邊溫育時間不可的疑問，其直接的結果是對一些弱陽性標本的查看出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準備zui為關鍵的是，在實驗初步前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，以使試劑盒在運用前與室溫平衡。這么做的目的，首要是為了在后邊的溫育反應進程中，能使反應微孔內的溫度能較快地抵達所懇求的高度，以滿足測定懇求。其次，現在的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室運用時對所供給的濃縮液稀釋制作，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反應顯色前暫時制作。
三、ELISA試劑盒加血清樣本及反應試劑樣本
在現在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的參與幾乎是僅有的要運用微量加樣器參與樣本的進程。運用微量加樣器加樣有必要留心的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺起和發作氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易致使非特異吸附。濺起會對鄰近孔發作污染。出現氣泡則反應液界面有差異。試劑的參與在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要留心滴加的角度外，滴加的速度也很首要，滴加太快，很簡單出現重復滴加或加在兩孔之間的景象，這么就會在孔內的非包被區出現非特異吸附，然后致使非特異顯色。所以，有時候一份標本用一樣的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，一般便是上述加樣及試劑的差錯所形成的。