細(xì)胞凋亡事件發(fā)生時(shí)，會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)和核酸分子結(jié)構(gòu)的改變，形成新的表位。利用免疫學(xué)方法對(duì)這些表位進(jìn)行鑒定，有助于判斷樣本中細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生。
細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活，這種鈣和鎂依賴(lài)性核酸酶容易進(jìn)入的核小體間區(qū)解開(kāi)雙鏈DNA，產(chǎn)生單/低聚核小體片段，而核小體本身由于DNA與組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解。采用雙抗體夾心酶免疫法，應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu)，可特異性檢測(cè)細(xì)胞溶解物中的單/低聚核小體，從而判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。
【材料與試劑】
（1） 生物素標(biāo)記的小鼠抗-組蛋白單克隆抗體；
（2） 過(guò)氧化物酶（-POD）標(biāo)記的小鼠抗DNA單克隆抗體；
（3） 鏈霉親合素包被的微孔板；
（4） DNA-組蛋白復(fù)合物，作為陽(yáng)性對(duì)照；
（5） ABTS底物；
（6） 溶解緩沖液；
（7） 溫育緩沖液；
底物緩沖液；
培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞的裂解物（細(xì)胞裂解步驟：收集細(xì)胞，離心后，用200μl溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min）；
培養(yǎng)細(xì)胞的上清液；
血漿（血清）；
分光光度計(jì)
【操作步驟】
（1） 取樣品離心后（1000r/min， 10min），吸取20μl上清液，加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中；
（2） 另加入80μl免疫反應(yīng)試劑：含抗-DNA-POD、抗組蛋白-生物素及溫育緩沖液（按1:1:18混合），室溫下孵育2h（置搖床上，250r/min）；
（3） 棄上清，用300μl溫育緩沖液洗滌3次，小心移去洗滌液；
（4） 加入100μl底物緩沖液，室溫下孵育至顏色變化至適合（置平板搖床上）；
【結(jié)果判斷】
盡快作比色分析（10～20min內(nèi)），用底物緩沖液作空白對(duì)照，檢測(cè)波長(zhǎng)405nm，參考波長(zhǎng)492nm。
聚集值 = 樣品的mU（誘導(dǎo)凋亡處理的細(xì)胞） × 100
對(duì)照的mU（未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理的細(xì)胞）
注：mU=吸收值（10-3）=雙孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若樣品的吸收值超過(guò)比色測(cè)定范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測(cè)。
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